2-丁醇的分子模型(3-丁二醇的微生物工艺)
2-丁醇的分子模型(3-丁二醇的微生物工艺)
2024-11-25 09:44:04  作者:星座书上  网址:https://m.xinb2b.cn/tech/wlu272002.html

2,3-丁二醇的微生物工艺

摘要:2,3-丁二醇是一种重要的化工原料和液体燃料,被广泛应用于化工、食品、医药、燃料及航空航天等多个领域,其生产方法主要为生物转化法。目前生物转化法生产2,3-丁二醇大多数用葡萄糖作为碳源,而葡萄糖的价格较高,且存在与人争粮、与粮争地的问题。此外,由于2,3-丁二醇具有较强的亲水性和较高的沸点,且发酵液成分复杂,因而该产品下游分离比较困难。原料成本高、产品分离困难已经成为2,3-丁二醇大规模工业化生产的瓶颈。因而迫切需要采用新的工艺,并且利用新的廉价的非粮原料作为底物发酵。

关键词:2,3-丁二醇;生物转化法;发酵工艺

1 2,3-丁二醇概况

2,3-丁二醇(CH3CHOHCHOHCH3,英文名称2,3-Butanediol,缩写2,3-BD),也成2,3-双羟基丁烷,二亚甲基二醇。因其分子中含有两个手性碳原子,所以存在三种旋光异构体,分别为D-(-)-2,3-丁二醇、L-( )-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇,它们的结构如图1-1所示。


图1-1 2,3-丁二醇立体异构体

Fig1-1 The stereoisomers of 2,3-butanediol

2,3-丁二醇在常温下是一种无色无味透明的液体,具有吸湿性;相对分子量为90.12g/mol;bp为178~182℃;mp为23~27℃;燃烧值为2.7198kJ/g;与水混溶,溶于乙醇、乙醚。

2 2,3-丁二醇的生产方法

生产2,3-丁二醇的方法主要有化学法和生物转化法。

目前化学法生产2,3-丁二醇主要以石油裂解产生的四碳类碳氢化合物在高温、高压下水解得到的。该方法难度大,生产成本高,过程繁琐,不易操作,所以一直很难实现大规模工业化生产,从而也限制了2,3-丁二醇用途的充分开发。

而生物转化法生产2,3-丁二醇采用可再生资源作为原料,通过微生物代谢将单糖转化为目标常务,生物转化法相比化学合成法而言,既符合绿色化学的要求,又可以避免化学合成法的困难,同时可以实现人类社会生产由传统的以不可再生化石能源为原料的石油炼制向可再生物质能源为原料的生物炼制转型,逐渐减少对日益枯竭的石油资源的依赖。该方法在技术上相对比较成熟,如果能够充分开发出2,3-丁二醇的应用,将形成一个新的行业。

自然界有很多微生物都可以代谢生产2,3-丁二醇,目前用来发酵生产2,3-丁二醇的微生物准要是细菌类,包括克雷伯氏菌属(Klebsiella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)和沙雷氏菌属(Serratia),其中克雷伯氏菌属和芽孢杆菌属研究最多。

芽孢杆菌属具有产生淀粉酶和木聚糖酶的能力,因而可以直接利用淀粉类物质为底物,但其代谢副产物的量较大,目标产物转化率较低;克雷伯氏菌虽然缺乏直接糖化淀粉的能力,但其底物食谱范围也较宽,如葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖等都是良好的碳源,发酵也较为彻底,对底物利用率高,且副产品乙醇的量较少,2,3-丁二醇的产量较高,因此相对来讲克雷伯氏菌是更具有工业化生产2,3-丁二醇前景的菌种。

为了获得更高浓度的产物和转化率,国内外众多学者在2,3-丁二醇产生菌的菌种诱变筛选方面也做了很多的努力。利用诱变技术以及复合诱变等方法获得高产以及遗传稳定性高的菌种。

现如今,随着基因工程和代谢工程研究的进展,利用基因工程改造菌种以提高菌种2,3-丁二醇产物的表达受到了重视。Blomqvist等发现表达2,3-丁二醇途径关键酶乙酰乳酸脱羧酶、乙酰乳酸合成酶和乙偶姻还原酶位于Klebsiella terrigena VTT-E-74023的同一个操纵子budABC上,budA编码α-乙酰乳酸脱羧酶,由259个氨基酸残基组成,分子量为29.2 kDa,budB编码α-乙酰乳酸合成酶,该酶分子量为60 kDa,budC编码乙偶姻还原酶,由4个相同大小(25 kDa)的亚基组成,且该操纵子在Enterobacter aerogenes中也被发现。现今最高的菌种达到的生产强度高达4.21g·L-1 h-1。Peng等将表达2,3.丁二醇关键酶的基因导入Escherichia coli,当用tac作为启动子时,导入Escherichia coli的L.( )-2,3-丁二醇基因得到了高强度的表达。Klebsiella pneumonia IAMl063中meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因的序列,它包含256个氨基酸残基,分子量为26.59 kDa,与Klebsiella terrigena VTT-E·74023相比,前196氨基酸的同源性高达92.9%,但196以后的氨基酸基本不同,而且两株菌有着类似的催化特性,该结果表明在第196号以后的氨基酸与酶的活性不相关;为了让微生物只生成单一构型的目标产物,Ui等还利用基因工程手段构建了多株仅产单一构型2,3.丁二醇的重组菌,比如将Klebsiella pneumonia IAMl063中2,3.丁二醇代谢途径的相关酶基因导入Escherichia coli JMl09,并用葡萄糖做底物,可获得高光学纯度的meso-2,3-丁二醇。

3 2,3-丁二醇的生物转化法生产

许多种碳水化合物都可以用来生产2,3-丁二醇,如葡萄糖、果糖、木糖、核糖、阿拉伯糖等多种六碳糖和五碳糖,其中葡萄糖是最常用的碳源。除了直接利用上述五碳糖和六碳糖作为碳源外,也有一些学者研究了较为廉价的原料作为底物发酵生产2,3-丁二醇,如乳清、糖蜜、纤维素以及工业其他废料等。

3.1 生物转化法生产2,3-丁二醇的代谢途径


生物转化法合成2,3.丁二醇是一个以产生2,3-丁二醇为主,同时伴有乙醇、乙酸、乳酸、琥珀酸和甲酸等副产物生成的过程。Demas等提出了生物转化法生产2,3-丁二醇过程中葡的代谢反应可用上述方程式描述。

3.2 生物转化法生产2,3-丁二醇的工艺

为了能对生产过程进行必要的控制,在发酵过程中需要对有关工艺参数进行定期取样测定或连续测量,其中对发酵过程影响较大的参数有pH、温度、溶解氧浓度、添加外源因子以及发酵方式等。

(1)pH值对生物转化法生产2,3.丁二醇的影响

pH值对2,3.丁二醇生成途径的影响作用是非常大的。由于2,3.丁二醇生产途径是一个多副产物的途径,包括乙醇、乙酸、甲酸、乳酸和琥珀酸等。每种产物都有其最适生产的pH值,而且都是不同的。为了确保发酵的顺利进行,必须使其各个阶段处于最适pH值范围之内,这就需要在发酵过程中不断地调节和控制pH值的变化。一般来说,发酵液偏碱比较容易生成有机酸。而较偏酸环境下有机酸产量急剧下降,同时2,3.丁二醇产量提高。2,3-丁二醇生产的最适pH值主要与底物和菌种有关,对于于E .aerogenes来说,菌体生物量在pH5~7之间是增加的,而2,3.丁二醇生产的最佳pH在5.5~6.5之间;多粘拟芽孢杆菌(Paenibacillus polynuya)在恒化器中生产2,3.丁二醇的最佳pH为5.7~6.3之间,随着pH值的提高,2,3.丁二醇和乙醇的产量增加,但是2,3.丁二醇的光学纯度降低;Jansen等发现Klebsiella oxytoca木糖为碳源时,pH值为5.2时菌体生长最快,2,3-丁二醇的产量也最大。Mickelson等在利用Aerobacter indologenes生物转化生产2,3-丁二醇的研究中发现,在厌氧条件下以2%的葡萄糖为底物,如果pH值为中性,产物主要是有机酸,如果pH值控制在6.3或6.3以下,有机酸合成会减少10倍以上,而2,3.丁二醇产量会提高到3.7倍。所以,要获得高产量2,3.丁二醇就必须找到其最佳pH值。

(2)温度对生物转化法生产2,3.丁二醇的影响

温度对发酵过程的影响是多方面的,由于酶活力很大程度上依赖于温度,因此温度会影响各种酶反应的速率,改变菌体代谢产物的合成方向,影响微生物的代谢调控机制。此外,温度还对发酵液的理化性质产生影响,如发酵液的粘度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等,进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。

(3)氧对生物转化法生产2,3.丁二醇的影响

氧是影响2,3-丁二醇发酵的极其重要参数。因为氧气供应的速率可以导致各种代谢途径的产生。


图1.2 有氧条件下糖底物的代谢途径

Fig1。2 The pathways of substrate metabolism under aeration conditions

(4)培养基的优化以及外源因子的添加对发酵过程的影响

国内外的专家学者做了大量的实验,发现在发酵过程中,添加一定的外源因子可以有效的促进微生物合成2,3-丁二醇。在发酵前期或菌体对数生长期时,添加柠檬酸、富马酸、α-酮戊二酸已经苹果酸中的一种或几种,可以显著提高产物浓度和生产强度、除了添加有机酸可以促进微生物合成2,3-丁二醇,添加维生素以及微量元素等营养因子也有一定的作用。

(5)培养方式对发酵过程的影响

培养方式主要有分批发酵、连续发酵、分批补料发酵、细胞循环发酵和萃取发酵。其中以连续发酵较为常用,连续发酵是以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基,同时以相同速度流出培养液,从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。通常情况下,微生物连续发酵中会形成一个稳定的状态。在稳态下,微生物所处的环境条件,如营养浓度、产物浓度、pH值等都能保持恒定。微生物细胞的浓度及其生长速率也维持不变。

3.3 发酵液中产物的检测方法

在微氧或厌氧条件下,克雷伯氏菌发酵葡萄糖,除了产生2,3-丁二醇和乙偶姻。同时产生琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇等副产物。在实验过程中,产物的分析方法主要采用气相色谱法和液相色谱法。

4 2,3-丁二醇的分离过程

从发酵液中分离提取亲水性的多元醇一直是困扰研究者的难题。有效地分离提取2,3-丁二醇也是制约其产业化的瓶颈之一,主要原因是2,3.丁二醇具有较强的亲水性和较高的沸点(达到180℃),而且发酵液中成分非常复杂,除菌体以外,还含有大量水分、少量蛋白质、核酸和多糖等生物大分子,以及乙醇、乙酸、葡萄糖、有机盐和无机盐等小分子杂质,这使得该提纯过程非常困难。

通常来讲,在生物物质的分离过程中需经过四个基本的分离阶段,这就是细胞及不溶性物质的去除、产品的提取和浓缩、产品的提纯以及产品的最后加工。

发酵液中包含了菌体、胞内外代谢产物、胞内的细胞物质及剩余的培养基残分等。首先要进行发酵液的预处理和菌体回收,只有将固、液分离开,才能从澄清的滤液中采用物理、化学的方法提取目标产物2,3.丁二醇。而从培养液中回收菌体是固.液分离的难题,工业上采用的分离方法多为高速离心法或板框过滤法以及微孔膜分离法。用高速离心法处理发酵液,设备投入成本高、能耗大;采用板框过滤法难以进行封闭操作,且需要较大的动力输出,滤布的清洗也较麻烦;采用膜过滤法又存在膜污染严重、膜清洗困难、成本高等缺点,理想的效果是寻找一种廉价、简便可靠的回收方法。

发酵液经过预处理后,需要通过进一步的分离对产品进行纯化。对于醇.水体系的分离,传统的方法是蒸馏和精馏。但由于发酵液中2,3.丁二醇浓度较低(8%--10%),因而蒸馏时就需要把占体系总量90%以上的水蒸发,整个过程耗能巨大,更重要的是,2,3-丁二醇沸点高达180℃,在达到蒸馏温度之前,发酵液中的可溶部分就会浓缩成较厚的油状积块,从而减慢2,3.丁二醇的蒸发速率,因此不宜采用减压蒸馏的方法来提取。对于2,3-丁二醇分离方面的文献报道主要分离方法包括:逆流气提法、溶剂萃取法、膜蒸馏和全蒸发技术等。

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