导读
现如今，转录组学研究范围几乎覆盖全部的研究领域，包括农林领域，畜牧业，海洋水产，生物医药，环境科学，已经成为生物科技研究的必备利器。转录组学在农学领域有五大黄金应用方向：生长发育、胁迫响应、免疫互作、突变表型、品质研究，其中生长发育和胁迫响应研究项目所占比例最多。随着三代全长测序技术的出现（如PacBio），转录组研究内容变得丰富多彩。通过全长转录组测序，我们不仅可以获得全长序列，还可进行可变剪切、APA、融合基因，新基因的研究，大大丰富了研究内容，提高了论文的质量。
对于无参物种、基因组组装或注释不完善的物种，用普通的二代无参转录测序，我们将会获得不好的转录本序列信息，注释和定量结果。对于这种情况，我们可以采用PacBio单样本全长转录组方案设计模式，利用三代获得全长转录本库，作为二代数据的参考基因组使用，大大提升了数据质量。接下来小编给大家解读两篇鲤鱼应对胁迫反应机制的成功案例，从实验方案设计，分析内容，发表文章IF分数，我们可以充分了解到三代PacBio测序的优势。
英文标题：Effect of ammonia stress on transcriptome and endoplasmic reticulum stress pathway for common carp (Cyprinus carpio) hepatopancreas
中文标题：转录组分析揭示氨胁迫对鲤鱼肝胰腺内质网应激途径的影响
发表杂志：Aquaculture Reports.2021
影响因子：3.216
合作单位：东北农业大学动物科学与技术学院
DOI：10.1016/j.aqrep.2021.100694
研究材料
普通鲤鱼（45.44±2.57 g）取自中国哈尔滨市黑龙江水产研究院呼兰养鱼场。在实验条件下养殖20天，期间溶解氧、水温和pH值是：5.0 ± 0.65 mg/L, 23 ± 0.63◦C, 7.50 ± 0.81。
试验方法
一个对照组和一个治疗组（96小时氨水胁迫，0.85 mg/LNH3），采样时间设置为0小时（对照组）、12小时、48小时和96小时（治疗组）。其他验证方法：RT-PCR验证转录组数据一致性性；TUNEL分析和免疫荧光实验。
测序策略
Illumina HiSeq；取0小时（对照组：L01、L02、L03），氨胁迫96小时（实验组：L04、L05、L06）作为转录组分析，每组3个重复，构建了6个测序文库。
研究背景
鲤鱼是全球养殖最广泛的鱼类。随着养殖密度的增加，鲤鱼养殖面临着严峻的环境压力。氨是一个重要的环境胁迫因素，对繁殖过程产生重大影响。对鱼类的毒性作用通常被认为是由NH3引起的，NH3是高度脂溶性的，由于氨在生物体内积累，它很容易通过细胞膜，疾病在鳃、肾和肝组织中，降低免疫力，阻碍生长，甚至死亡。然而，关于致病性和应激的分子机制的基本基因组信息尚不充分。
主要内容
用RNA-seq技术研究氨胁迫下鲤鱼肝胰腺的基因表达谱，共有3367个单基因被鉴定为与氨胁迫相关的差异表达基因（DEG）。1724 DEG下调，1643 DEG上调。KEGG分析将这些DEG的代谢途径分为49个不同的terms。85个DEGs显著富集在内质网（ko04141）的蛋白质加工途径中。许多DEG在内质网应激（ERS）途径和ko04141通路中的未折叠蛋白反应（UPR）信号通路中显著富集。ERS和UPR通路参与了肝胰腺细胞对氨应激的反应。RT-PCR和转录组学结果表明，PERK-eIF2α和IRE1-xbp1通路参与了氨胁迫诱导的肝胰腺细胞对ERS的反应。TUNEL分析结果证实，氨胁迫诱导肝胰腺细胞凋亡。此外，在氨胁迫下，ERS通过PERK-eIF2α-CHOP和IRE1-XBP1-CHOP信号通路诱导肝胰腺细胞凋亡。该文为鲤鱼的应激反应提供了新的思路，是首次对氨胁迫下鲤鱼肝胰腺转录组进行了研究。
部分结果展示
英文标题：Integrative Transcriptomic Analysis Reveals the Immune Mechanism for a CyHV-3-Resistant Common Carp Strain
中文标题：转录组分析揭示CyHV-3抗性鲤鱼品系的免疫机制
发表杂志：Frontiers in immunology.2021
影响因子：7.561
合作单位：中国水产科学院黑龙江水产研究所
DOI：10.3389/fimmu.2021.687151
研究材料
德国镜鲤G4：CyHV-3抗性筛选后的第四代，G4（实验组）和非抗病育种品系（对照组）用于病毒胁迫。
实验方法
将患病鱼内脏匀浆溶液添加到水箱中，从而诱导CyHV-3感染两个品系。
测序策略
Illumina测序：实验组和对照组分别取病毒刺激后第0天和第7天，获得前肾样本，每组3个生物学重复。PacBio全长测序：取肝脏、脾脏和肾脏的混合物，各两生物学重复。
转录组分析的策略
研究背景
鲤鱼疱疹病毒-3（CyHV-3）感染是鲤鱼养殖的主要威胁，可导致鲤鱼大量的死亡。CyHV-3可通过削弱宿主的免疫系统而使其死亡，导致其对病原微生物易感性，并可能在感染后6至10天内出现发病和死亡。感染CyHV-3后存活下来的鲤鱼可以抵抗这种病毒未来的感染。由于CyHV-3在鲤鱼中存在潜伏期和持续性携带期，遗传背景对于了解对病毒的耐药性至关重要。德国镜鲤品系G4是中国广泛栽培的鲤鱼品系，但因CyHV-3病毒引起高死亡率。然而目前在研究抗CyHV-3免疫机制的详细免疫系统网络方面，还缺乏系统的研究。最近的研究表明，lncRNAs在不同类型病原体感染时的广泛差异表达，表明LncRNAs在鱼类免疫反应中起着关键作用。然而，在CyHV-3感染期间，鲤鱼体内的特异性LncRNA对免疫反应的调节尚未被研究。第三代测序（如PacBio）可以解码比第二代测序方法（如Illumina）更长的基因序列，包括mRNA和非编码RNA在内的更高质量的转录本组装，可能提供对遗传抗性机制的更详细理解。在本研究中，为了揭示鲤鱼抗CyHV3育种中涉及的免疫机制，使用图1所示的策略，对CyHV-3激发期间的mRNA和长非编码RNA（lncRNA）进行了整合转录组学分析。对来自繁殖品系或非繁殖品系的存活鲤鱼和健康对照鲤鱼的免疫相关转录本进行了分析。
研究内容
在CyHV-3感染后第0天和第7天提取鲤鱼头肾组织，并通过Illumina和PacBio测序分析转录组。在对涉及的GO term和KEGG途径进行分析。加权基因共表达网络分析用于揭示lncRNA对免疫基因的调节。结果表明，繁殖鲤鱼品系通过一种特定的先天免疫机制对CyHV-3感染产生了显著的抗性,主要的生物学过程是自噬、吞噬、细胞毒性和凝集素和MUC3阻断病毒。此外，还有免疫抑制信号途径，如IL21R对STAT3的抑制，PI3K介导的感染时多巴胺对炎症的抑制，以及NLRC3在稳定状态下对STING的抑制。从非抗性品系中还发现了CyHV-3的可能易感因素，如ITGB1、TLR18和CCL4。本研究结果还表明，LncRNA调节的Nramp和PAI分别促进病毒感染和感染细胞的增殖，而T细胞白血病同源框3(TLX3），以及lncRNA的半乳糖凝集素3可能在抗病制中发挥作用。因此，免疫遗传不敏感或易受CyHV-3感染的免疫因子已被揭示。
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